平板划线分离法是一种纯化培养物的技术，指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
一、划线平板的制备
采用无菌操作将10-15mL熔化并已灭菌的培养基倒入灭菌的培养皿中。小心操作以避免污染.注意在倾倒平板前，应将试管或三角瓶外壁的水擦干防止水滴滴入平皿造成污染。取掉棉塞后，三角瓶或试管的口部要灼烧。培养皿的盖子不要打开得太大，只要能将培养基倒入即可
平板中的培养基固化后才可使用，注意培养基表面必须干燥.因为水分的存在不利于分离菌落的产生。平板在37℃培养箱中放置20~60min。先将平皿盖放在培养箱中，然后将装有培养基的培养皿扣放在平皿盖上。
这种干燥方法可以避免尘埃的污染。另外一种干燥方法是将平皿在培养箱中多放置几天，直到盖上的凝结水全部蒸发，采用这种方法时，不要将平皿盖打开，平皿按通常的方式反转堆放。这也有利于识别制备过程中受到污染的平皿。
如果实验室有超净工作台，也可以将平皿放到工作台中干燥，平皿的上下两部分分开并将培养基表面朝上放置。但采用这种干燥形式，使用前要进行污染检查，因为若工作台没有小心维护或没有定期更换过滤膜，很可能造成严重污染。
二、平板划线操作步骤（分区划线）
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并打开试管塞。
3、将试管口通过火焰。
4、将已经冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。
5、将试管口通过火焰，塞上试管塞。
6、左手将平皿打开一条缝隙，右手将沾有菌液的接种环快速伸入平板内，在平板1区划3~5条平行线。
7、取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60~70°，右手把接种环在火焰上灼烧，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60~70°，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，盖上皿盖，置于培养箱中培养。
三、平板划线操作要点
1、每换一次角度，接种环要充分灼烧，这样更容易得到单个菌落。
2、用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。
3、为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。
